辛伐他汀保护小鼠急肝衰竭肝损伤

时间:2019-09-09

  

辛伐他汀保护小鼠急肝衰竭肝损伤

  目前认为, 内毒素血症和微循环障碍导致的继发性肝损伤在肝衰竭的发生发展过程中发挥重要作用[16]. 病毒、药物、酒精等直接或免疫损伤致肝细胞坏死和局部炎症反应, 炎症反应导致微循环障碍造成缺血缺氧进一步加重肝细胞死亡, 促进内毒素血症的发生, 最终加速肝细胞死亡和肝衰竭的发生和进展. 基于辛伐他汀保护内毒素血症和缺血再灌注引起的肝损伤, 改善微循环障碍和肝硬化肝窦内皮细胞功能障碍, 推测辛伐他汀具有改善微循环障碍对急性肝衰竭具有保护作用. 为验证上述假说进行本研究.

  肝衰竭素, 而血清6 h的HMGB1水平无差异. IL: 白介素; TNF: 肿瘤坏死因子.

  败血症和肝硬化内毒素血症导致肝窦内皮细胞功能障碍, LPS抑制肝窦内皮细胞NO产生, 增加肝脏血管阻力[14]. 近年来的研究发现, 辛伐他汀改善败血症和肝硬化门脉高压患者肝窦内皮细胞功能障碍, 减轻肝损伤[41012]. 最近发现, 辛伐他汀保护肝移植缺血再灌注损伤, 其作用是通过改善内皮细胞功能障碍, 抑制炎症反应和氧化应激减少肝损伤[15]. 本研究发现辛伐他汀增加急性肝衰竭动物肝脏eNOS和P-eNOS, 降低肝组织超氧化物水平. 肝脏eNOS和P-eNOS主要由肝脏血管内皮细胞产生, 因此, 辛伐他汀增加血管内皮细胞eNOS和P-eNOS表达, NO水平增加改善急性肝衰竭微循环障碍, 同时降低氧化应激反应, 保护微循环障碍继发性肝细胞损伤.

  1.2.3 血清生化和细胞因子检测:全自动生化分析仪检测ALT, 血清HMGB1和IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10和超氧化物检测按照生产厂家说明书进行, 根据标准品获得标准曲线 免疫印迹及其分析:免疫印迹及其分析: 取 0.5 g肝组织研磨后加入1 mL含蛋白酶抑制剂混合物的双蒸水混匀-80 ℃保存, 取10 µL样品加入90 µL RIPA高效裂解液(碧云天, 中国)充分裂解, 6000 g离心30 s, 加入50 µL上样缓冲液, 聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜上, 10%的BSA在4 ℃封闭过夜, 一抗37 ℃孵育2 h, 1:10000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体37 ℃孵育0.5 h, 化学发光法检测结果, Quntity one分析软件进行灰度分析.

  近年来的研究显示, 诱导自噬保护多种诱因的急性肝细胞损伤. 为了解辛伐他汀的肝脏保护作用与肝细胞自噬有关, 免疫印迹检测不同治疗组肝脏LC3Ⅱ表达显示, 辛伐他汀组肝脏LC3Ⅱ表达较急性肝衰竭组高(图5). 表明辛伐他汀促进急性肝衰竭肝细胞自噬.

  为了解辛伐他汀对急性肝衰竭肝脏微循环障碍和氧化应激的影响, 免疫印迹检测肝脏eNOS和P-eNOS水平显示, 急性肝衰竭小鼠肝脏eNOS和P-eNOS较PBS对照组明显降低, 辛伐他汀治疗增加其表达水平(图4A). 测定各处理组肝组织过氧化物水平显示, 辛伐他汀治疗组肝脏超氧化物浓度比值显著低于肝衰竭对照组(

  A: 免疫印迹检测肝脏LC3Ⅱ表达; B: 以PBS组为1.0比较不同处理组肝脏LC3Ⅱ表达, 辛伐他汀治疗组LC3Ⅱ表达较肝衰竭组增高,

  2.3 辛伐他汀治疗减轻肝衰竭小鼠肝组织炎症坏死和HMGB1肝细胞移位

  结果: 辛伐他汀组1 wk生存率为83.3%显著高于肝衰竭对照组的33.3%(P0.01); 6、12、24和48 h血清ALT水平显著低于急性肝衰竭组(P0.01). 辛伐他汀组6和12 h的HMGB1水平以及24 h的IL-1β水平显著低于肝衰竭对照组(P0.01), 肝脏炎症坏死和HMGB1胞浆移位较对照明显减轻. 辛伐他汀增加急性肝衰竭动物肝脏eNOS、P-eNOS和LC3Ⅱ表达水平, 降低肝组织超氧化物水平.

  急性肝衰竭对照组肝细胞大片状坏死, 坏死区大量炎症细胞浸润(图3C), 肝脏 HMGB1不仅在胞核表达, 大量肝细胞胞浆有明显表达(图3D). 辛伐他汀治疗组肝小叶结构基本完整, 局灶肝细胞嗜酸性变, 无炎症细胞浸, HMGB1胞浆表达肝细胞较少(图3E3F). 图像分析对照组HMGB1肝细胞移位率显著高于辛伐他汀治疗组(

  : 课题设计由雷延昌主持; 研究过程由罗盼与李雯实施; 论文写作由雷延昌完成.: 雷延昌, 主任医师, 330006, 江西省南昌市洪都中大道167号, 南昌大学附属感染病医院.

  肝衰竭继发性肝损伤的另外一个重要因素是肝脏微循环障碍, 肝脏炎症反应导致微循环障碍, 造成了缺血缺氧性损伤, 缺血缺氧直接导致肝细胞死亡, 肝细胞大量死亡, 肝脏解毒能力降低、肠道屏障功能障碍、免疫抑制等, 促进内毒素血症的发生, 内毒素血症加速了肝细胞的死亡[16].

  肝衰竭组. eNOS: 内皮型一氧化氮合酶; P-eNOS: 磷酸化内皮型一氧化氮合酶.

  = 18)血清细胞因子水平. A: 血清细胞因子水平, 辛伐他汀治疗组12 h的TNF-α、IL-6和抗炎因子IL-10水平与肝衰竭组无差异, 两组IL-1β水平差异有显著性,

  1.2.2 标本收集:腹腔注射D-GaIN/LPS后6、12、24、48 h对存活动物眼眶采血分离血清置于-80 ℃保存. 分别于12和24 h处死部分动物, 肝组织用40 g/L中性甲醛固定, 进行免疫组织化学检测HMGB1表达和肝脏病理分析.

  最近研究显示, 细胞自噬可以选择性清除损伤的线粒体, 保护线粒体损伤诱导的细胞死亡. 促进肝细胞自噬可以保护对乙酰氨基酚、D-GalN/LPS以及酒精对小鼠的肝细胞毒性, 抑制肝细胞自噬增加TNF-α和D-GalN诱导的肝细胞凋亡及损伤[2729]. 虽然LPS可以促进肝细胞自噬, 但D-GalN抑制LPS诱导的肝细胞自噬[29]. 本研究发现辛伐他汀增加急性肝衰竭小鼠肝脏LC3BⅡ表达水平, 促进肝细胞自噬, 是保护肝损伤的机制之一.

  A: 免疫印迹检测不同处理组肝脏eNOS和P-eNOS表达; B: 各处理组肝脏过氧化物水平.

  结论: 辛伐他汀对急性肝衰竭具有保护作用, 其机制与改善内皮细胞功能障碍、氧化应激和促进肝细胞自噬有关.

  检验, 两个样本率的比较用χ2检验,P0.05为差异有统计学意义.

  内毒素血症和肝脏微循环障碍所继发的肝损伤在肝衰竭的发生发展过程中具有重要作用目前已得到共识[16]. 肝衰竭内毒素血症发生率可高达90%-100%, 内毒素血症产生的LPS刺激巨噬细胞或枯否细胞释放大量炎症因子加重肝损伤. 氯化钆部分清除肝脏枯否细胞, 显著降低D-GalN/LPS诱导小鼠急性肝损伤, 提高生存率[21]. 近年来发现, 后期炎症因子HMGBl在急性肝衰竭发生和疾病的严重程度密切相关[12], 急性肝衰竭发生肝细胞HMGB1胞浆移位[22]. HMGB1可通过LPS刺激巨噬细胞和血管内皮细胞等主动释放, 亦可由坏死肝细胞被动释放[2326], HMGB1促进TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8释放和外周单核细胞趋化因子释放, 募集更多炎症细胞加剧炎症反应和组织损伤. 本研究显示, 与急性肝衰竭对照组比较, 辛伐他汀组血清12 h的HMGB1和IL-1β水平显著降低, 而TNF-α、IL-1β、IL-6以及抗炎因子IL-10的水平无差异. 然而, 辛伐他汀治疗组肝脏炎症坏死和肝细胞HMGB1胞浆移位显著减轻. 由于HMGB1既可通过巨噬细胞LPS刺激产生, 又可通过坏死肝细胞被动释放, 提示辛伐他汀对LPS刺激巨噬细胞或枯否细胞炎症因子释放的影响较小, 不是其保护肝衰竭肝细胞损伤的主要机制.

  A: 正常小鼠肝组织HE染色; B: 正常小鼠肝脏细胞HMGB1表达在胞核; C: 急性肝衰竭组小鼠肝细胞片状坏死, 坏死区大量炎症细胞浸润; D: 急性肝衰竭组小鼠大量肝细胞胞浆表达HMGB1, 发生HMGB1胞浆移位; E: 辛伐他汀治疗组仅出现局灶性肝细胞坏死; F: 辛伐他汀治疗组仅发生少量HMGB1胞浆移位; G: 肝细胞HMGB1胞浆移位率. 辛伐他汀治疗组肝细胞HMGB1胞浆移位率显著低于肝衰竭组,

  肝衰竭素; B: 血清HMGB1水平, 辛伐他汀治疗组12和24 h血清HMGB1水平显著低于肝衰竭组,

  D-GalN/LPS腹腔注射是目前比较成熟的小鼠急性肝衰竭模型, 较好的模拟肝衰竭发病机制. ♂Balb/c小鼠腹腔注射D-GalN/LPS 1 wk生存率为33.3%, 动物死亡发生在给药后12-24 h , 与作者之前的研究一致[1718]. 辛伐他汀治疗组小鼠1 wk生存率为83.3%显著高于肝衰竭对照组的33.3%. 急性肝衰竭小鼠血清ALT水平在6 h开始升高, 12 h达高峰, 24 h开始下降并逐渐恢复正常, 与国外的研究和作者近来的研究结果一致[171920]. 辛伐他汀治疗组显著降低血清ALT水平和肝脏炎症减轻, 显示其保护急性肝衰竭肝损伤保护作用.

  本研究显示辛伐他汀提高急性肝衰竭小鼠生存率, 降低血清ALT水平, 改善肝脏炎症坏死和HMGB1肝细胞胞浆移位, 增加急性肝衰竭动物肝脏eNOS、P-eNOS和LC3BⅡ表达水平, 降低肝组织超氧化物水平, 但对LPS刺激巨噬细胞或枯否细胞炎症因子释放的影响较小. 因此, 辛伐他汀对急性肝衰竭具有保护作用与改善内皮细胞功能障碍、氧化应激和促进肝细胞自噬有关. 该结果为辛伐他汀保护肝衰竭肝细胞损伤提供了新的理论基础, 具有重要的理论和应用价值. 此外, 辛伐他汀与核苷类抗乙型肝炎病毒药物联合增加其病毒抑制作用[30]. 因我国肝衰竭大部分是慢性乙型肝炎引起效应, 应用辛伐他汀治疗慢性乙型肝炎肝衰竭值得进一步研究.

  统计学处理所有数据用SPSS18.0软件作统计学分析, 数据资料以mean±SD表示, 生存率比较采用Log-rank检验, 重复测量设计资料分析采用方差分析, 两组间比较应用独立样本

  核心提示:辛伐他汀改善肝脏内皮细胞功能障碍、氧化应激和促进肝细胞自噬保护急性肝衰竭肝损伤.

  1.2.1 动物模型及分组:Balb/c小鼠♂实验前12 h禁食, 不禁水. 动物随机分为3组: 正常组、急性肝衰竭组和辛伐他汀组, 每组18只. 急性肝衰竭组给予D-GaIN(600 mg/kg)和LPS(10 μg/kg)腹腔注射, 辛伐他汀治疗组在腹腔注射D-GaIN/LPS前3 d每日给予辛伐他汀(25 mg/kg)灌胃, 正常组和急性肝衰竭对照组在相应时间点等量PBS灌胃.

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